♣ Protein Labeling Kit

Protein labeling kit 는 dojindo사에서 2005 ~ 2006 년에 걸쳐 개발 중인 신제품입니다.

ALP-labeld, HRP-labeled antibody 및 형광으로 표지된 항체나 단백질은 western blot이나 ELSA와 같은 아주 일반적인 Immunoassay 뿐만 아니라 최근 많이 이용되기 시작한  FACS나 Confocal microscopy를 이용한 monitoring시에 유용한 tool로 이용되고 있습니다.  실험자는 이런 enzyme이나 형광probe를 목적단백질에 conjugation 시키기위해 몇가지 방법을 씁니다. 가장 많은 경우로 이미 labeled된 단백질을 구입하는 것인데 대표적인 경우로 secondary antibody가 그것입니다. 특정단백질을 검출하기 위해 그 단백질에 specific하게 결합하는 일차 항체를 사용한후 다시  그 일차 항체에 결합하는이차 항체를 반응 시키는데 이차 항체에는 기질 과반응하여 발색을 유도하는 HRP같은 enzyme이나 FITC같은 형광물질이 결합되어 있습니다.  아주 간편하고 저렴한 가격에 labeled antibody를 구입해서 사용할수 있으나 만약 표지하고자하는 단백질이 monoclonal antibody나 어떤 특정 단백질인경우라면 이렇게 enzyme이나 형광물질로 표지된 항체나 단백질을 일일히 구입하는 것이 쉽지 않습니다. 잘 알려지지 않은 단백질의 monoclonal antibody나 small molecule에 대하여  competitive ELISA를 하는 경우 등이 있을것입니다.   그렇다면 이번에는 이들 단백질에 필요한 시약을 직접 구입하여 conugation 시켜야 할것입니다

 그러면 단백질을 conjugation시키는 방법에 대해 가장 널리 사용되는 peroxidase labeling을  예를 들어 설명해보겠습니다.

일반적으로 HRP를 conjugate 하는 방법은 다음 그림과 같습니다.

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그림에서 Glutaldehyde method 는 유명한 Pier~사의 제품이 사용하는 방법이고 Periodate method는 역시 유명한 스위스의 Ro~사 제품이 사용하는 방법 입니다.

둘다 peroxidase 를 activation시키는 방법에 따라 구별한 것인데 공통적으로 overnight incubation이나 장시간에 걸친 dialysis과정이 포함된, 2일정도 소요되는 작업입니다. 이것은 상업적으로 판매되는 kit이지만  mannual  방식과 큰 차이는 없습니다. 이것은 아주 일반적으로 사용되는 방법이며     특히 대량의 protein abeling이 용이합니다. 만약 어느 회사에서 HRP-conjugated antibody를 구입하여 사용하고 계시다면 이 방법들을 이용하여 conjugation한 제품일것입니다.

다음으로 Dojindo사의 protein labeling kit를 보겠습니다. Dojindo의 HRP labeiling kit가 사용하는 방법은 다음 그림으로 요약됩니다.

Glutaraldehyde method나 Peridate method에 비해 간단합니다. 간단할 뿐만 아니라 labeling에 소요되는 시간도 빠릅니다.  별도의 enzyme ativation과정 없이 activated ester group을 가진 peroxidase는 target molecule의 amine group 과 쉽게 covalent bond를 형성하므로 반응이 쉽고 sample protein의 전처리  과정이나 conjugate의 회수 과정에서 dialysis 도 필요 없습니다. Recovery단계에서도 gel permeation이나 dialysis에 의한방법과 달리 filtration tube를 사용하여 회수율을 높였습니다

그럼 결과물을 비교해 보겠습니다

Biotine labeling의 경우는 좀더 차이가 두드러집니다

물론 모든면에서 기존의 방법보다 비교 우위에 있는 것은 아닙니다. ALP labeling으 경우 Dojindo의 ALP-labeling kit-NH2 보다 Periodate method를 사용면 더 좋은 결과를 얻을수 있습니다. 하지만 이역시 Dojindo의 ALP-labeling kit-SH 를 사용한것보다는 sensiivity가 낮습니다.

대부분의 Immuniassay 시 간혹 비특이적인 결합과 배경 염색이 문제가 되지만 Secondary antibody를 사용하는 방법을 많이 쓰는 것은 그 편리함 때문입니다.  또한 항체에 표지하는 과정에서, 예를들어 항원 인식부위에 표지가 된다면 항체의 활성이 감소하거나 없어지는 경우가 많은데  특히 항체가 monoclonal antibody인 경우에 이러한 현상이 두드러집니다.

Dojindo 의 Protein Labeling kit는 짧은 반응시간으로 기존 사용방법의 불편함을 완전히 해소하였을 뿐 아니라 Labeling efficiency 와 회수율을 높였고, 또한   단일클론 항체의 결합능력에 영향을 주지 않고 표지가 가능해 Primary Antibody method에서도 편리함-specificity-sensitivity-high signal 모두를 충족 시킬수 있게 되었습니다

Dojindo 의 labeling kit 는 다음과 같은 제품들이 있습니다